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本文構(gòu)建了一個負載羰基鐵簇合物的納米平臺（FeCORM NPs），通過化學(xué)動力學(xué)治療（CDT）和免疫原性細胞死亡（ICD）誘導(dǎo)的免疫治療，對黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出優(yōu)異的療效。羰基鐵簇合物納米粒子可由谷胱甘肽（GSH）和過氧化氫（H2O2）引發(fā)，通過配體交換和氧化還原破壞途徑釋放CO并生成亞鐵鹽，釋放的CO導(dǎo)致線粒體損傷，而生成的亞鐵鹽通過Fenton反應(yīng)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。另一方面，納米材料誘導(dǎo)基于ICD的免疫治療，與CDT共同作用，通過小鼠模型顯示出極好的抗黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移效果。這項工作構(gòu)建一個簡單穩(wěn)定的納米平臺，利用**中相對較高水平的GSH和H2O2來啟動治療效果，從而使納米平臺能夠區(qū)分正常細胞和**細胞。該系統(tǒng)不僅在治療黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，而且在抑制其他類型的**轉(zhuǎn)移。

惡性黑色素瘤（MM）是一種來源于皮膚黑色素細胞的惡性**，很容易擴散到淋巴結(jié)、肝、肺、腦和其他器官。肺是其最常見的遠處轉(zhuǎn)移靶點。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，其預(yù)后和治療都會很困難。為了提高黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的生存率，需要更有效、更特異的治療策略，盡管這些策略具有挑戰(zhàn)性。免疫原性細胞死亡（ICD）越來越被認為是一種細胞死亡途徑，已成為癌癥免疫治療（IMT）的策略之一。基于外部刺激的療法，如光動力療法（PDT）、放射療法（RT）、光熱療法（PTT）。然而，基于**微環(huán)境（TME）等內(nèi)部刺激誘導(dǎo)ICD具有挑戰(zhàn)性。作為一種微創(chuàng)治療策略，化學(xué)動力學(xué)療法（CDT）是一種通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生高度細胞毒性活性氧（ROS）（例如：·OH、1O2和O2·–）的有前景的TME反應(yīng)性治療。癌細胞中高于毒性閾值的ROS水平可能壓倒抗氧化系統(tǒng)，并啟動ICD以調(diào)節(jié)死亡癌細胞的免疫原性，這是一種更好的協(xié)同治療策略。因此，需要設(shè)計單一成分的平臺，使用內(nèi)源性刺激誘導(dǎo)和增強ICD，而癌癥IMT的療效不會受到影響。在此，我們報告了一種新的納米平臺（FeCORM NPs），即負載有二鐵六羰基化合物（FeCORM）的納米顆粒，該納米顆粒不含額外成分且對TME具有響應(yīng)性。在組裝過程中，采用聚苯乙烯-馬來酸共聚物-聚（乙二醇）-聚（乙二醇）（PSMA-PEG）作為載體，通過載體與鐵羰基化合物之間的疏水作用來負載FeCORM NPs，從而形成納米顆粒。FeCORM NPs可與過氧化氫（H2O2）和谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成活性氧（ROS）并在癌細胞中釋放一氧化碳（CO），從而誘導(dǎo)CDT和ICD誘導(dǎo)IMT，在體內(nèi)對黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移顯示出良好的效果。

FeCORM NPs通過鐵羰基絡(luò)合物（FeCORM，C8H4Fe2O6S2或[Fe2（μ-SCH2）2（CO）6]，和聚苯乙烯-馬來酸鈷-聚乙二醇-聚乙二醇（PSMA-PEG）之間的疏水-疏水相互作用進行自組裝。TEM圖像顯示，F(xiàn)eCORM NPs呈球形，尺寸為～60納米。通過動態(tài)光散射測量FeCORM NPs的平均流體動力學(xué)直徑為65±2 nm。納米顆粒表面帶負電荷，測量電位為?33.2±3.4 mV。帶負電的表面確保了膠體系統(tǒng)在水中的高穩(wěn)定性。通過監(jiān)測長達14天的流體動力學(xué)直徑，其在鹽水和水中的長期穩(wěn)定性得以保持。
圖1。（a） FeCORM NPs在水中的粒徑和穩(wěn)定性；（b） FeCORM與H2O2、FeCORM和FeCORM NPs反應(yīng)物的FTIR光譜；（c） 37 ℃條件下，在不同培養(yǎng)時間，PBS中脫氧Mb和FeCORM NPs的紫外-可見光譜變化；（d） 以5,5-二甲基-1-吡咯啉氧化物（DMPO）為探針的電子自旋共振（ESR）光譜；（e） 3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在不同濃度H2O2的NaAc-HAc緩沖溶液；（f）在NaAc–HAc緩沖溶液中652 nm處的TMB吸收光譜，其中含有不同含量的FeCORM NPs。
在目前的系統(tǒng)中，GSH確實被用于促進FeCORM NPs的CO釋放，這是使用以肌紅蛋白（Mb）為探針的紫外-可見光譜法進行監(jiān)測的。在540和577 nm處出現(xiàn)了兩條新的吸收帶，表明由于FeCORM NPs釋放CO而形成MbCO。在存在10 mM GSH的情況下，納米顆粒的CO釋放在50 min內(nèi)完成。除了TME中相對較高濃度的GSH外，還存在H2O2，每104個細胞每小時的H2O2濃度高達0.5 nmol。H2O2的存在確實觸發(fā)了CO釋放。在存在H2O2的情況下，納米顆粒的尺寸在24小時內(nèi)變大，這可能是由于釋放CO導(dǎo)致納米顆粒結(jié)構(gòu)的變化。。這種H2O2響應(yīng)機制不像GSH觸發(fā)的CO釋放那樣通過配體交換，而是通過金屬中心的氧化。XPS數(shù)據(jù)證實了FeCORM NPs和H2O2混合物中存在Fe（II）。考慮到CO釋放過程中產(chǎn)生的Fe（II）物種以及H2O2的存在，可能會發(fā)生Fenton反應(yīng)。我們使用3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）作為探針來檢測其Fenton活性。FeCORM NPs和H2O2在pH 5.2下的混合物以及5,5-二甲基-1-吡咯啉氧化物（DMPO）作為自由基捕獲劑，以1:2:2:1的特征比產(chǎn)生電子自旋共振（ESR）信號，這表明捕獲的自由基是羥基自由基（?OH）。?OH的生成取決于FeCORM NPs和H2O2的濃度以及反應(yīng)時間。這些結(jié)果表明，F(xiàn)eCORM NPs在釋放CO時對GSH和H2O2都有反應(yīng)。H2O2引發(fā)的CO釋放也伴隨著通過Fenton反應(yīng)生成?OH，自由基可能在CDT中具有潛在用途。
為了評價FeCORM-NPs在體外的治療效果，我們使用了以下兩種細胞系：癌細胞（B16-F10）和正常細胞（HUVEC）。通過MTT試驗獲得的細胞存活率，在B16-F10和HUVEC的IC50值分別為45.4和72.6μM的情況下，納米平臺在孵育24小時后在癌細胞和正常細胞之間顯示出一定程度的分化。為了確定過氧化氫和谷胱甘肽在體外是否都能誘導(dǎo)CO釋放，并隨后產(chǎn)生ROS，從而損傷所檢測的B10-F10細胞，分別使用L-丁硫氨酸-亞砜肟（L-BSO）和過氧化氫酶（CAT）抑制細胞中的GSH和H2O2，然后定量分析B16-F10細胞的存活率。所有細胞用Annexinv-FITC/PI凋亡試劑盒標(biāo)記，流式細胞儀分析。L-BSO+CAT+FeCORM NPs組的細胞存活率高達95.6%，而僅與FeCORM NPs孵育的細胞存活率為31.5%。無論是單用L-BSO還是單用CAT，存活率都有顯著提高，分別為88.9%和67.6%，這是由于CAT和L-BSO抑制H2O2和GSH所致。這些數(shù)據(jù)表明，細胞內(nèi)H2O2和GSH是導(dǎo)致細胞活力低下的主要因素。GSH和H2O2都引發(fā)了鐵羰基化合物的分解，在此期間，F(xiàn)e（II）和H2O2共存將通過Fenton反應(yīng)途徑生成ROS，細胞死亡可以合理地歸因于ROS自由基和靶向線粒體釋放的CO。
圖2。（a） B16-F10和HUVE細胞的IC50值分別與不同濃度的FeCORM NPs在37°C下孵育24小時；（b） 用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI共培養(yǎng)的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)與不同處理；（c） （b）的定量分析；（d） 用FeCORM NPs孵育不同時間的細胞的共聚焦激光共聚焦顯微鏡圖顯示ROS和釋放的CO；（e） 圖像J定量分析（d）；（f） 處理對帶FeCORM NPs的B16-F10細胞線粒體膜電位（Δψm）的影響；（g） 并用ImageJ對（f）進行定量分析。
共焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS和CO。使用ROS檢測試劑盒（2′，7′-二氯熒光素，DCF探針）和CO探針（COP-1）檢測存在FeCORM NPs時產(chǎn)生的細胞內(nèi)ROS和CO。如熒光強度所示，由FeCORM NPs產(chǎn)生的ROS和CO的細胞內(nèi)數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。在延長培養(yǎng)時間后，流式細胞術(shù)的結(jié)果也觀察到相同的熒光強度變化趨勢。線粒體膜電位探針JC-1被用于評估FeCORM NPs誘導(dǎo)的細胞線粒體損傷。對照組細胞線粒體中的JC-1呈聚合物形式，顯示明亮的紅色熒光。當(dāng)存在FeCORM NPs時，由于B16-F10細胞的線粒體膜電位降低，JC-1不能作為聚合物存在于線粒體基質(zhì)中。因此，線粒體中的紅色熒光強度顯著減弱，而細胞質(zhì)中的綠色熒光強度顯著增強，這表明線粒體受到嚴(yán)重損傷。通過添加ROS清除劑（VC）來抑制細胞內(nèi)的ROS水平，從而大大恢復(fù)了明亮的紅色熒光，表明細胞線粒體損傷顯著減少，從而進一步證明了由于存在FeCORM NPs而導(dǎo)致的細胞內(nèi)ROS及其對線粒體的損傷。對照組、FeCORM NPs組和FeCORM NPs+VC組的綠色和紅色熒光強度比分別為0.004、1.5和0.3，定量顯示了納米平臺造成的線粒體損傷。
為了研究FeCORM NPs引發(fā)的ICD，評估了經(jīng)FeCORM NPs處理24小時的B16-F10細胞中CRT暴露水平和HMGB1釋放。CLSM和流式細胞術(shù)用于檢測細胞表面CRT暴露。在FeCORM NPs處理組中觀察到代表細胞表面CRT的鮮紅色熒光，而當(dāng)添加ROS清除劑（VC）時，紅色熒光消失，表明癌細胞表面CRT表達受到抑制。結(jié)果有力地證明了活性氧誘導(dǎo)的CRT細胞表面易位。流式細胞術(shù)也獲得了相同的結(jié)果。此外，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分析HMGB1的釋放。與對照組和FeCORM NPs+VC組相比，F(xiàn)eCORM NP組顯著提高了B16-F10細胞HMGB1的釋放。因此，F(xiàn)eCORM NP介導(dǎo)的CDT可以在B16-F10細胞中誘導(dǎo)ICD。
圖3。（a） 在37°C條件下，分別用FeCORM NPs和FeCORM NPs+VC（抗壞血酸，0.05 mg/mL）處理B16-F10細胞24小時；（b）用ImageJ定量分析（a），（C）流式細胞術(shù)檢測B16-F10細胞CRT暴露；（d）用ELISA試劑盒檢測HMGB1釋放量。

我們進一步評估了FeCORM NPs的體內(nèi)性能。通過靜脈注射5×105 B16-F10黑色素瘤細胞在免疫活性BALB/c小鼠中構(gòu)建黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型。第4天，通過尾靜脈向小鼠注射FeCORM NPs懸浮液。每三天注射一次，對照組同樣注射生理鹽水。在第4天、第7天、第10天和第13天，在下一次注射之前移除荷瘤小鼠的肺，然后計算肺轉(zhuǎn)移位點，并在對小鼠實施安樂死后拍攝照片。第4天，肺轉(zhuǎn)移未完全形成，因為對照組和使用FeCORM NPs的治療組之間沒有顯著差異。第7天，治療組的肺轉(zhuǎn)移位點數(shù)（186.7±18.0）比對照組（254.7±52.9）低約30%。在接下來的三天內(nèi)，治療組（168.3±31.7）和對照組（294.7±45.1）均未觀察到顯著變化。然而，進一步的治療顯示出顯著的差異，因為在第13天，治療組的肺轉(zhuǎn)移位點數(shù)量迅速下降至34.7±10.5，而對照組的肺轉(zhuǎn)移位點數(shù)量（333.3±24.5）比FeCORM NPs組高10倍。結(jié)果表明，F(xiàn)eCORM NPs顯著抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的生長。小鼠平均肺重量的變化也證明了治療的效果。與第4天的平均肺重量相比，治療組的平均肺重量下降了約25%，而由于黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的增長，對照組的平均肺重量在第13天增加了50%以上。此外，各組肺部的蘇木精和曙紅（H&E）以及HMGB1染色圖像。用藍色箭頭或圓圈突出顯示的區(qū)域代表肺轉(zhuǎn)移區(qū)域。這些結(jié)果與肺轉(zhuǎn)移位點的計算結(jié)果一致。所有這些結(jié)果都表明FeCORM NPs可以抑制肺轉(zhuǎn)移。對肺轉(zhuǎn)移的神奇抑制可能不僅歸因于CDT，還與小鼠免疫系統(tǒng)的激活有關(guān)。
圖4。（a） 治療過程示意圖；b）第4天、第7天、第10天、第13天小鼠肺重量的變化；（c）平均和個別肺轉(zhuǎn)移位點；（d）不同干預(yù)措施中靜脈注射的小鼠H&E染色肺的典型圖像。

如上所述，我們認為納米平臺對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的療效可能部分來自于激活小鼠的免疫反應(yīng)。在第8天對荷瘤小鼠實施安樂死后，收集荷瘤小鼠的肺、引流淋巴結(jié)和脾臟。通過對肺、引流淋巴結(jié)和脾臟的CRT染色檢查CRT暴露。細胞核區(qū)域發(fā)出藍色熒光，細胞膜上的CRT曝光呈紅色。使用ImageJ計算CRT的平均熒光強度，F(xiàn)eCORM NPs組在肺、引流淋巴結(jié)和脾臟中的紅色熒光強度比分別為17.6±2.3、18.2±0.04和7.6±0.2。這些結(jié)果表明，由于在**區(qū)域有效積累FeCORM NPs，導(dǎo)致CRT暴露顯著，從而誘發(fā)ICD。眾所周知，CRT暴露（DAMP之一）是DC成熟的關(guān)鍵刺激。通過使用流式細胞術(shù)分析第8天從荷瘤小鼠肺和脾臟獲得的DC成熟的兩個生物標(biāo)記物（CD80和CD86）來評估DC成熟。與對照組相比，F(xiàn)eCORM NPs治療組的DC成熟率在肺和脾臟都增加了一倍以上。這些結(jié)果堅定地證明了FeCORM NPs介導(dǎo)的CDT通過ICD誘導(dǎo)抗**免疫反應(yīng)的效力，以及CRT暴露的增加和DC在體內(nèi)的成熟，這使得納米平臺具有抗黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的強大功效。
圖5。（a） 實驗過程示意圖，小鼠肺內(nèi)有B16-F10**；（b） 小鼠肺、引流淋巴結(jié)和脾臟切片中CRT表達的代表性熒光圖像；（c） （b）的定量分析；（d） 代表性流式細胞術(shù)圖顯示不同組小鼠肺和脾臟中DC細胞成熟（CD11c/CD80/CD86）的比例；（e）定量分析（d）。

活化的DC可進一步促進**組織周圍T淋巴細胞的募集和分化。用免疫熒光染色法對患有黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的小鼠的CD8 T和CD4 T細胞水平進行了研究。綠色熒光強度形成鮮明對比，表明對照組和FeCORM NPs治療組之間的CD4和CD8 T細胞水平。兩種類型T細胞的定量分析表明，與生理鹽水組相比，治療組的所有三種組織都顯著增加，盡管這些組織中的分化增加。與對照組相比，肺中的細胞毒性CD8 T細胞幾乎增加了80倍，而脾臟中的CD4 T細胞幾乎增加了30倍；在使用FeCORM NPs治療后，三種組織中觀察到最顯著的增加。對于其余的組織，兩個T細胞從幾倍增加到大約30倍。這些結(jié)果表明，納米材料引發(fā)了小鼠的整體免疫反應(yīng)，以產(chǎn)生強大的抗**T細胞。ICD誘導(dǎo)的這些免疫反應(yīng)進一步刺激了適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括免疫促進細胞因子（如TNF-α）的產(chǎn)生，用ELISA評估**中的TNF-α水平，F(xiàn)eCORM NPs組（1220.2±40.2 ng/L）顯著高于生理鹽水組（754.1±165.9 ng/L）。增加的細胞因子進一步增強了納米材料抗**細胞的功效。結(jié)果很好地證明了ICD是細胞死亡的途徑之一，因此證明了納米平臺FeCORM NPs對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的活性。
圖6。（a） 小鼠肺、引流淋巴結(jié)和脾臟切片中CD4和CD8標(biāo)記物的代表性熒光圖像；（b） （a）的定量分析；（c）ELISA試劑盒檢測血液中TNF-α的含量。

我們構(gòu)建了一種新型TME反應(yīng)性納米平臺FeCORM NPs，用于包括CO、CDT和ICD觸發(fā)的IMT在內(nèi)的聯(lián)合治療。在TME中，GSH和H2O2引發(fā)了納米平臺FeCORM NPs的CO釋放，在此過程中還生成了亞鐵鹽，可引發(fā)一系列細胞內(nèi)活性，協(xié)同抑制黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。FeCORM NPs介導(dǎo)的CDT誘導(dǎo)基于ICD的抗**免疫反應(yīng)，**細胞DAMP釋放增加，成熟DC比例增加，激活了**中的T淋巴細胞。體外和體內(nèi)研究均證實了其對**的有效作用。

Tumor Microenvironment-Activated Nanoparticles Loaded with an Iron-Carbonyl Complex for Chemodynamic Immunotherapy of Lung Metastasis of Melanoma In Vivo, Tianli Zhai, Wei Zhong, Yucong Gao, Han Zhou, Zhiguo Zhou, Xiaoming Liu*, Shiping Yang, and Hong Yang*, Angew. ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 33, 39100–39111

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