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pH敏感性多肽藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展?fàn)顩r

根據(jù)pH響應(yīng)機(jī)制、多肽種類及載體材料的不同,可以將pH敏感性多肽藥物遞送系統(tǒng)分為5種類型: pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng); pH響應(yīng)性多肽自組裝藥物釋放系統(tǒng); pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)藥物傳遞系統(tǒng); pH敏感性寡肽介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng); pH敏感型載體材料與細(xì)胞穿膜肽共修飾納米粒。

1.1 pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)

細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs) 是一種由10～30個(gè)氨基酸殘基組成的陽(yáng)離子短肽。細(xì)胞穿膜肽能介導(dǎo)多種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞,如DNA、蛋白質(zhì)、抗體、顯像劑、納米粒和脂質(zhì)體等[9]。將CPPs與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物 (如紫杉醇、喜樹(shù)堿和鬼臼毒素等)共價(jià)連接后,能明顯提高這些藥物的抗腫瘤活性,同時(shí)也增強(qiáng)了這些藥物的水溶性、組織滲透力及在腫瘤組織中的分布[10]。然而,由于細(xì)胞穿膜肽的選擇性較差、正電荷多而引起的體內(nèi)系統(tǒng)毒性、穩(wěn)定性差等問(wèn)題,使其在體內(nèi)的應(yīng)用受到了限制。因此,研究者想出了很多策略以提高細(xì)胞穿膜肽的腫瘤靶向性[11],如將腫瘤特異性靶向配體與細(xì)胞穿膜肽結(jié)合[12],或制成腫瘤靶向配體與細(xì)胞穿膜肽共修飾納米粒[13]和脂質(zhì)體[14]。

1.1.1 pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽

抗腫瘤藥物分子很難通過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),CPPs能克服此缺點(diǎn),攜帶各種治療物質(zhì)直接進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)而不滯留于溶酶體中[15]。但是,由于CPPs缺乏腫瘤特異性使其應(yīng)用受到了限制,人們?cè)噲D尋找到某些適宜的靶向策略,即在CPPs到達(dá)腫瘤組織之前設(shè)法屏蔽其結(jié)構(gòu)域,當(dāng)CPPs到達(dá)腫瘤組織后完全去屏蔽,從而規(guī)避非特異性攝取,以提高CPPs在腫瘤治療方面的應(yīng)用。

Transportan是由神經(jīng)甘丙肽的12個(gè)功能性氨基酸和黃蜂毒素通過(guò)賴氨酸連接而成的細(xì)胞穿膜肽,它通過(guò)能量非依賴通路穿過(guò)細(xì)胞膜,能激活Na+、K+-ATPase,導(dǎo)致溶酶體裂解,增加了藥物的生物利用度[16]。但Transportan的選擇性差,Soomets等[17]設(shè)計(jì)合成了一系列Transportan的類似物 (TP7～TP15)。其中,TP10具有顯著的膜轉(zhuǎn)位能力,它是由21個(gè)氨基酸殘基組成的細(xì)胞穿膜肽,能將多種物質(zhì)運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi),如寡核苷酸、核酸肽、蛋白質(zhì)及其他多肽類物質(zhì)[18]。

本課題組前期研究中,對(duì)TP10進(jìn)行了一系列的修飾改造,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP10-5(TK) 是TP10類似物中最有前景的一個(gè)[19]。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面所帶的負(fù)電荷多于正常細(xì)胞,所以TP10和TK通過(guò)靜電引力會(huì)優(yōu)先與腫瘤細(xì)胞結(jié)合,隨之進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但是相比之下,仍然有大量多肽分子進(jìn)入正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在整個(gè)滲透進(jìn)程中,多肽與細(xì)胞膜之間的靜電吸引作用最為關(guān)鍵,因此削弱兩者之間的靜電引力就會(huì)降低多肽的細(xì)胞內(nèi)攝作用,從而降低其細(xì)胞毒性。組氨酸的pKa ≈ 6.5,含組氨酸的多肽在pH ≤6.5時(shí) 會(huì)發(fā)生質(zhì)子化而帶正電荷,而在pH 7.4時(shí)大部分不帶電荷。為了克服TK特異性低、毒性大的缺點(diǎn),以TK[AGYLLGKINLKKLAKL(Aib)KKIL-NH2]為模板,將序列中的所有賴氨酸替換為組氨酸,合成了一種新型的具有pH選擇性且低毒性的細(xì)胞穿膜肽TH[AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-NH2][19]。研究發(fā)現(xiàn),與母肽TK相比,在pH 7.4條件下,TH細(xì)胞毒性及穿膜活性明顯降低; 當(dāng)pH 6.0時(shí),TH的細(xì)胞毒性、穿膜活性與pH 7.4時(shí)相比顯著增強(qiáng)。然而,母肽TK的活性在不同pH條件下并沒(méi)有明顯差別。這些結(jié)果均證明,TH在正常生理?xiàng)l件下不能被激活,但在腫瘤酸性環(huán)境中能夠被激活。這種酸激活細(xì)胞穿膜肽能選擇性地?cái)y帶小分子藥物、納米顆粒、膠束、聚合物、寡核苷酸、蛋白質(zhì)或熒光標(biāo)記物分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,以滿足各種應(yīng)用需要。

1.1.2 pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽修飾的脂質(zhì)體

近年 來(lái),納米藥物已經(jīng)成為治療惡性疾病的研究熱點(diǎn)[20]。實(shí)體瘤的滲透和滯留效應(yīng)(enhanced permeabilityandretention effect,EPR effect),使得脂質(zhì)體能有效地累積于腫瘤組織,降低游離藥物的毒性,從而引起了人們的廣泛關(guān)注[21]。人們常采用可裂解的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG) 對(duì)CPPs進(jìn)行修飾,制成納米載體,以降低傳統(tǒng)CPPs的非特異性滲透。由于腫瘤微環(huán)境呈弱酸性,增強(qiáng)CPPs腫瘤特異性的有效手段是對(duì)其進(jìn)行修飾改造,使之具有pH響應(yīng)性[22]。

由TP10衍生而來(lái)的TH具有非常顯著的pH敏感性,并且TH與喜樹(shù)堿(camptothecine,CPT) 的共軛物TH-CPT能優(yōu)先進(jìn)入酸性環(huán)境中的細(xì)胞[19]?；谝陨涎芯?/span>,Zhang等[23]將TH引入到脂質(zhì)體中,設(shè)計(jì)合成了一種pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽修飾的脂質(zhì)體TH- Lip。由于TH具有pH 敏感性,在血液循環(huán)及正常組織中,TH的穿膜活性被掩蔽; 當(dāng)TH-Lip到達(dá)腫瘤組織,TH序列中的組氨酸質(zhì)子化,使得TH-Lip表面電荷由負(fù)轉(zhuǎn)為正,TH的穿膜活性被激活,使腫瘤細(xì)胞對(duì)TH-Lip的攝取增加。體外研究發(fā)現(xiàn),包載紫杉醇 (paclitaxel,PTX) 的脂質(zhì)體PTX-TH-Lip能有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且具有pH依賴性。體內(nèi)研究表明,TH-Lip保留了脂質(zhì)體的長(zhǎng)循環(huán)特性,使其到達(dá)腫瘤組織后盡可能多地被腫瘤細(xì)胞攝取,從而避免了其他組織 (如肝臟、脾臟和腎臟等) 對(duì)TH-Lip的非特異性攝取。

TH-Lip為研發(fā)pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽修飾的藥物傳遞系統(tǒng)提供了一個(gè)全新的視角,繞開(kāi)正常組織或器官,直接到達(dá)腫瘤組織發(fā)揮抗腫瘤作用。

雖然TH-Lip表現(xiàn)出非常顯著的pH敏感性,卻不能主動(dòng)靶向至特定的腫瘤位點(diǎn)。靶向配體肽c (RGDfK) 是整合素ανβ3的有效配體[24, 25],由于整合素ανβ3高表達(dá)于B16F10細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤及肺癌細(xì)胞表面,因此Shi等[26]將RGDfK通過(guò)酯鍵連接到酸激活細(xì)胞穿膜肽TH的C末端,合成了新的肽鏈TR [c(RGDfK)-AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-NH2],使TR不僅能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的整合素ανβ3,而且具有pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜活性。將TR修飾到脂質(zhì)體表面,得到一種新型的pH 響應(yīng)性脂質(zhì)體TR-Lip。體外研究結(jié)果表明,TR-Lip保持了有效的pH響應(yīng)性,并且呈現(xiàn)出與整合素ανβ3很強(qiáng)的親和力。與TH-Lip相比,TR-Lip的優(yōu)勢(shì)在于它能主動(dòng)靶向整合素ανβ3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞。在pH 6.5條件下,將PTX包載于脂質(zhì)體中形成的PTX-TR-Lip抑制B16F10細(xì)胞活性比PTX-TH-Lip更強(qiáng)。該課題組以注射B16F10細(xì)胞的荷瘤小鼠為模型,研究了TR-Lip生物分布及PTX-TR-Lip體內(nèi)抗腫瘤活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TR-Lip能大量聚積于腫瘤組織; 與對(duì)照組相比,PTX-TR-Lip能顯著抑制腫瘤組織的生長(zhǎng),其腫瘤抑制率也高于PTX-TH-Lip組。更有趣的是,PTX-TR-Lip組的荷瘤小鼠存活率最高,這可能與PTX-TR-Lip高效地抗腫瘤活性有關(guān)。

總之,由于TR-Lip具有pH響應(yīng)性,又能主動(dòng)靶向至特定的腫瘤位點(diǎn),進(jìn)而可以大幅度地降低全身性毒性。然而TR-Lip也存在不足之處,雖然它的抗腫瘤活性得到了提高,但pH敏感性與TH-Lip相比略有降低。如果能克服此缺點(diǎn),將其研發(fā)成為疏水性抗腫瘤藥物的長(zhǎng)循環(huán)載體將具有明顯的優(yōu)勢(shì)。此外,Jiang等[27]用pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽R6H4 (RRRRRR HHHH-NH2) 和透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid,HA) 共修飾得到一種雙功能靶向脂質(zhì)體HA-R6H4-L,也表現(xiàn)出很好的pH響應(yīng)性腫瘤靶向功能。

1.2 pH響應(yīng)性多肽自組裝藥物釋放系統(tǒng)

自組裝多肽及其衍生物由于其很好的生物相容性、化學(xué)多樣性及生物識(shí)別能力,受到了極大的關(guān)注。近年來(lái),利用pH、溫度、光照、酶和化學(xué)物質(zhì)等外部條件刺激來(lái)調(diào)節(jié)多肽及其衍生物的自組裝,使其廣泛運(yùn)用于各個(gè)方面,如組織工程、藥物遞送、傷口愈合及抑制劑的篩選等。在這些外部條件中,pH的應(yīng)用最為廣泛,特別是在藥物控制釋放方面。因此,將pH響應(yīng)性智能藥物載體用于抗腫瘤藥物的靶向遞送具有潛在可能性。

Liang等[28]基于多肽自組裝系統(tǒng),設(shè)計(jì)出一種pH敏感型兩親性多肽分子 (VVVVVVKKGRGDS) 作為抗腫瘤藥物的載體。該多肽分子親水端頭部為KKGRGDS序列,其中兩個(gè)賴氨酸殘基能提供pH響應(yīng)能力,并入RGD序列賦予兩親性多肽分子腫瘤靶向功能; 疏水端尾部為VVVVVV序列,這6個(gè)纈氨酸殘基具有疏水性側(cè)鏈,能提供疏水性相互作用以促進(jìn)兩親性多肽分子的聚集和自組裝。在中性或堿性介質(zhì)中,這種兩親性多肽分子通過(guò)氫鍵及疏水相互作用自組裝成球形膠束,若改變介質(zhì)的pH使其變?yōu)樗嵝原h(huán)境,兩個(gè)賴氨酸殘基離子化,靜電排斥作用會(huì)阻止兩親性多肽分子自組裝,導(dǎo)致膠束解離。將阿霉素 (doxorubicin,DOX) 包封于兩親性多肽分子形成的自組裝膠束中,研究了pH的改變對(duì)藥物釋放的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在中性介質(zhì)中 (pH7.0) DOX的釋放持久,而在酸性介質(zhì)中 (pH 5.0) DOX釋放迅速。當(dāng)這種包封了DOX的自組裝膠束與HeLa細(xì)胞及COS7細(xì)胞共孵育時(shí),由于HeLa細(xì)胞表面有過(guò)表達(dá)的RGD受體(如ανβ3,ανβ5)[29]使該膠束能有效利用RGD序列的腫瘤靶向功能,繞開(kāi)COS7細(xì)胞,將DOX靶向輸送至HeLa細(xì)胞,從而達(dá)到特異性殺死腫瘤細(xì)胞的目的。值得注意的是,這種兩親性多肽分子表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性很低。

因此,將這種pH 響應(yīng)性自組裝藥物釋放系統(tǒng)作為抗腫瘤藥物的載體,不僅靶向性好、安全性高,而且能夠?qū)崿F(xiàn)控制釋放,具有很好的臨床應(yīng)

pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)藥物傳遞系統(tǒng)

近年來(lái),pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)藥物傳遞系統(tǒng)在控制釋放及靶向傳遞藥物方面展現(xiàn)了極大的優(yōu)越性。這種pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)藥物傳遞系統(tǒng)一旦受到外部pH的刺激,自身所帶的負(fù)電荷會(huì)轉(zhuǎn)化為正電荷,從而發(fā)揮其相應(yīng)作用。值得注意的是,納米粒表面所帶的電荷在細(xì)胞內(nèi)化及血液穩(wěn)定性中扮演著重要角色。這種電荷反轉(zhuǎn)納米粒在中性條件下 (如在血液中) 能夠保持最初所帶的負(fù)電荷,從而抑制其與血清蛋白及正常組織的非特異性結(jié)合; 一旦到達(dá)腫瘤組織或核內(nèi)體就會(huì)迅速反轉(zhuǎn)為正電荷形式,促進(jìn)腫瘤組織對(duì)電荷反轉(zhuǎn)納米粒的攝取,實(shí)現(xiàn)控制釋放。

Han等[30]運(yùn)用pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)策略,設(shè)計(jì)合成了一種新型的pH敏感性電荷反轉(zhuǎn)聚合多肽納米粒PPDTS[PLLeu-PLL(DMA)-Tat(SA)]。這種納米粒能將抗腫瘤藥物靶向輸送至腫瘤組織,由于腫瘤組織具有微酸性細(xì)胞外環(huán)境 (pH ≈ 6.5),并且腫瘤細(xì)胞中的核內(nèi)體也呈弱酸性 (pH ≈ 5.0),因此該納米粒通過(guò)對(duì)腫瘤組織微酸性環(huán)境的逐級(jí)響應(yīng),提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的細(xì)胞攝取。這種pH敏感性電荷反轉(zhuǎn)聚合多肽納米粒的基本結(jié)構(gòu)為聚L-賴氨酸-聚-L-亮氨酸二嵌段共聚物(PLLeu-PLL),將所有賴氨酸上的-NH2用2,3-二甲基馬來(lái)酸酐酰胺化后形成β-羧酰胺,使得該聚合多肽自組裝成帶負(fù)電荷的納米粒。通過(guò)鏈接反應(yīng)將聚合多肽與細(xì)胞核靶向肽Tat共價(jià)連接在一起,然后用琥珀酰氯將Tat上的兩個(gè)賴氨酸和一個(gè)谷氨酸殘基酰胺化,掩蔽了其所帶的正電荷及細(xì)胞穿膜功能,這樣就抑制了Tat的非特異性細(xì)胞攝取。這種pH敏感性電荷反轉(zhuǎn)聚合多肽納米粒的響應(yīng)機(jī)制 為: 當(dāng)PPDTS到達(dá)微酸性的腫瘤組織,β-羧酰胺就 會(huì)水解,使得納米粒由負(fù)電荷轉(zhuǎn)化為正電荷,然后迅速被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化。當(dāng)納米粒被內(nèi)化進(jìn)入到更酸性的核內(nèi)體中時(shí),Tat琥珀酰胺進(jìn)一步水解,使得Tat靶向細(xì)胞核的功能被激活,導(dǎo)致納米粒更多地進(jìn)入細(xì)胞核。該課題組將抗腫瘤藥物DOX包封于納米粒中,形成PPDTS/DOX,當(dāng)該微粒到達(dá)細(xì)胞核后,DOX就會(huì)被釋放,累積于細(xì)胞核,發(fā)揮抗腫瘤作用。

這種pH依賴性電荷反轉(zhuǎn)藥物傳遞系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 是: 有助于同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向攝取和抗腫瘤藥物的細(xì)胞核遞送。為抗腫瘤藥物的靶向遞送研究提供了新思路。

1.4 pH敏感性寡肽介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)1.4.1 pH響應(yīng)性寡肽自組裝納米粒

腫瘤組織微環(huán)境最顯著的標(biāo)志之一就是失調(diào)的pH值。利用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)出一種具有特異性及敏感性的成像探針靶向作用于腫瘤微環(huán)境。大多數(shù)pH敏感性納米粒都是由長(zhǎng)鏈聚合而成的,對(duì)于pH的刺激響應(yīng)慢。智能pH響應(yīng)性納米粒,最大的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)pH的變化能快速應(yīng)答。如果納米粒的反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),就會(huì)重新進(jìn)入血液循環(huán),導(dǎo)致其靶向腫瘤的效率降低[31]。Zhao等[32]設(shè)計(jì)了一種基于寡肽自組裝的仿生納米結(jié)構(gòu) —— pH敏感肽KS5-DEAP2分別與熒光染料A488、熒光猝滅劑BHQ-5共價(jià)連接后自組裝形成的雜合肽納米粒,只要微環(huán)境pH發(fā)生輕微改變 (由7.4變?yōu)?/span>6.8),這種納米粒就能快速地從自組裝期 (熒光猝滅) 切換至解離期 (有熒光)。該課題組利用腫瘤異種移植小鼠模型,通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式,研究了寡肽自組裝納米粒的體內(nèi)腫瘤成像。結(jié)果顯示,注射1.5 h內(nèi),隨著時(shí)間的推移,瘤內(nèi)的熒光逐漸增強(qiáng); 1.5h后,腫瘤內(nèi)的熒光強(qiáng)度逐漸降低。說(shuō)明一旦該探針遇到酸性的腫瘤微環(huán)境就會(huì)迅速并完全解離,從而產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號(hào)。有趣的是,與不易解離的多肽組裝體相比,這種pH響應(yīng)性寡肽自組裝納米粒在腫瘤內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度消退速度更快。這就意味著,自組裝納米粒的解離組分一旦被代謝為小分子物質(zhì),就會(huì)通過(guò)自由擴(kuò)散從機(jī)體內(nèi)清除。此外,研究發(fā)現(xiàn)熒光染料主要定位于細(xì)胞膜水平。

由于這種pH響應(yīng)性自組裝寡肽納米粒對(duì)腫瘤酸性微環(huán)境的靈敏度高,且能及時(shí)從機(jī)體內(nèi)清除,若將其作為診斷腫瘤的熒光探針應(yīng)用于臨床,具有一定的準(zhǔn)確性和安全性。

1.4.2 pH敏感性寡肽與細(xì)胞穿膜肽的重組體

MAP(KLALKLALKALKAALKLA) 是一種兩親性CPPs,能通過(guò)胞吞作用攜帶多種生物活性分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),但是作為藥物載體又缺乏特異性。組氨酸-谷氨酸 (histidine-glutamic acid,HE) 共聚物是一種pH高 度敏感性序列,為了阻止MAP非特異性攝取,Zaro 等[33]運(yùn)用生物技術(shù)手段將寡肽HE與細(xì)胞穿膜肽MAP融合在一起,得到一種重組體HE-MAP,并被谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST) 表達(dá)為融合蛋白GST-HE-MAP。在該研究中,GST一方面作為標(biāo)記物用于蛋白的純化,另一方面作為貨物蛋白用于研究重組體HE-MAP的物質(zhì)傳遞功能是否具有pH依賴性。結(jié)果顯示,在pH ≤ 6.8時(shí),GST- HE-MAP能與HeLa細(xì)胞高度結(jié)合并被細(xì)胞內(nèi)化; 當(dāng)pH > 7時(shí),GST-HE-MAP與HeLa細(xì)胞的結(jié)合及內(nèi)化明顯降低,說(shuō)明HE賦予了該融合蛋白高度的pH敏感性。這主要是由于組氨酸 (pKa ≈ 6.5) 在pH 7.4時(shí)不帶電荷,而帶負(fù)電荷的谷氨酸 (pK a ≈ 4) 與帶正電荷的賴氨酸 (pKa ≈ 10) 或精氨酸 (pKa ≈ 12) 通過(guò)靜電相互作用可以屏蔽MAP上的正電荷。一旦重組體HE-MAP暴露于微酸性環(huán)境,組氨酸發(fā)生質(zhì)子化而帶正電荷,導(dǎo)致谷氨酸殘基與MAP上的陽(yáng)離子殘基之間的靜電相互作用被解除,從而使MAP的細(xì)胞穿膜活性被激活。

基于上述研究,Fei等[34]又將寡肽HE重復(fù)序列(HE)10與MAP融合,探究了融合蛋白GST-(HE)10- MAP在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布情況。結(jié)果證實(shí),在正常生理?xiàng)l件下 (HE)10能夠掩蔽MAP的穿膜活性,導(dǎo)致GST-(HE)10-MAP選擇性地分布在微酸性的腫瘤位點(diǎn)。

(HE)n重復(fù)序列與CPPs融合得到的重組體 (HE)n-CPPs,若改變 (HE)n重復(fù)序列的長(zhǎng)度,是否能夠調(diào)節(jié)CPPs所帶的正電荷數(shù)目,從而使得CPPs的穿膜活性發(fā)生不同程度的改變?；谶@個(gè)假設(shè),Sun等[35]將寡肽序列 (HE)n (n = 8,10,12) 分別與陽(yáng)離子細(xì)胞穿膜肽YG(RG)6、YGR6G6連接,形成六種結(jié)構(gòu)不同的重組體 [(HE)8-YG(RG)6、(HE)10-YG(RG)6、(HE)12-YG(RG)6、(HE)8-YGR6G6、(HE)10-YGR6G6和 (HE)12-YGR6G6],并考察了這6種重組體與HeLa細(xì)胞的表面結(jié)合及細(xì)胞攝取是否具有pH敏感性。結(jié)果顯示,(HE)10-YGR6G6的pH敏感性最高。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn),重組體的pH敏感性與它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)及 (HE)n重復(fù)序列的長(zhǎng)度有關(guān); 也與CPPs 中精氨酸的排列順序有關(guān)。

根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道,可以推測(cè)若將這種pH敏感性重組體 (HE)n-CPPs作為傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的載體,不僅能克服CPPs選擇性差、正電荷多等缺點(diǎn),又能提高傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的水溶性、組織滲透能力及在腫瘤組織的分布。此外,也可以將熒光探針與這種pH敏感性重組體 (HE)n-CPPs連接,應(yīng)用于腫瘤診斷。因此,pH敏感性寡肽與細(xì)胞穿膜肽的重組體在抗腫瘤藥物靶向遞送,特別是在大分子療法方面具有一定的應(yīng)用前景。

1.4.3 pH敏感性寡肽與細(xì)胞穿膜肽共修飾聚合物膠束

為了抑制機(jī)體對(duì)抗腫瘤藥物的非特異性攝取,同時(shí)提高聚乙二醇-聚乳酸 (poly(ethylene glycol)- poly(D,L-lactide),PEG-PLA)聚合物膠束的物理穩(wěn)定性以及腫瘤靶向性,Quahab等[36]用pH敏感性寡肽 (HE)5與細(xì)胞穿膜肽 (RG)5對(duì)PEG-PLA聚合物膠束進(jìn)行共修飾,將 (HE)5、(RG)5分別連接到PEG-PLA的聚乙二醇末端,使得組裝后多肽分子位于膠束表面 (PHPO)。同時(shí),將抗腫瘤藥多烯紫杉醇(docetaxel,DTX) 包封于聚合物膠束PHPO中,制成載藥聚合物膠束DTX-PHPO。研究發(fā)現(xiàn),DTX-PHPO的體外釋放及細(xì)胞攝取具有明顯的pH依賴性。這主要?dú)w功于寡肽(HE)5的pH敏感性[33, 34]。在pH 7.4時(shí),膠束表面的 (HE)5通過(guò)靜電相互作用屏蔽了(RG)5的穿膜活性; 一旦該膠束進(jìn)入腫瘤酸性微環(huán)境,(RG)5發(fā)生去屏蔽,其穿膜活性被激活,介導(dǎo)膠束進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,釋放出藥物分子,進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。

這種pH敏感性寡肽與細(xì)胞穿膜肽共修飾聚合 物膠束明顯改善了DTX水溶性差的缺點(diǎn)。與大多數(shù)納米藥物載體相似,該聚合物膠束也可以被動(dòng)靶向至腫瘤部位。又因其具有pH響應(yīng)性,當(dāng)?shù)竭_(dá)腫瘤組織后,能攜帶更多的難溶性藥物大分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。但是,若想使這類載體有更好的發(fā)展前景,pH敏感性寡肽和細(xì)胞穿膜肽的選擇至關(guān)重要,因?yàn)樗鼈冎g的靜電相互作用會(huì)直接影響到這類聚合物膠束能否進(jìn)入到正常組織和器官而引起系統(tǒng)性毒性作用。

1.5 pH敏感型載體材料與細(xì)胞穿膜肽共修飾納米粒

大多數(shù)靶向作用于腫瘤組織的pH敏感性多肽類藥物遞送系統(tǒng),主要通過(guò)對(duì)肽鏈的修飾改造,使其在微酸性腫瘤細(xì)胞外環(huán)境中具有pH響應(yīng)能力。而將pH敏感型的載體材料與細(xì)胞穿膜肽結(jié)合,應(yīng)用于腫瘤靶向型pH敏感性多肽類藥物遞送系統(tǒng)的文獻(xiàn)報(bào)道并不多見(jiàn)。

1.5.1細(xì)胞穿膜肽與pH敏感型PEG共修飾脂質(zhì)體

為了延長(zhǎng)脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,改善其生物相容性,常見(jiàn)的方法是用PEG對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾[37]。但是,PEG化后的脂質(zhì)體,其親水性表層會(huì)阻礙脂質(zhì)體與細(xì)胞之間的相互作用,導(dǎo)致脂質(zhì)體不能及時(shí)與細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)化,大大降低了藥物遞送效率。Zhang等[38]巧妙地用pH敏感型PEG (PEG5K-Hz-PE) 和細(xì)胞穿膜肽R8 (RRRRRRRR-NH2) 對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行共修飾得到一種既有長(zhǎng)循環(huán)特性,又有pH響應(yīng)性的脂質(zhì)體Cl-Lip。在血液循環(huán)中該pH敏感型PEG保持穩(wěn)定,可以屏蔽R8的穿膜活性。當(dāng)脂質(zhì)體通過(guò)EPR效應(yīng)靶向至腫瘤部位后,在腫瘤組織酸性微環(huán)境的誘導(dǎo)下,連接PEG的化學(xué)鍵水解斷裂,使得該pH敏感型PEG斷裂脫離脂質(zhì)體表面,R8去屏蔽化,介導(dǎo)脂質(zhì)體進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

該pH敏感型PEG與細(xì)胞穿膜肽共修飾脂質(zhì)體,為腫瘤靶向型pH敏感性多肽類藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)很好的思路?？梢赃M(jìn)一步將各種類型的細(xì)胞穿膜肽 (如酸激活穿膜肽、具有主動(dòng)靶向功能的細(xì)胞穿膜肽、裂解肽與細(xì)胞穿膜肽的重組體) 運(yùn)用于此類共修飾脂質(zhì)體,再將傳統(tǒng)抗腫瘤藥物包封于其中,發(fā)揮多重、靈敏、高效的腫瘤靶向及抗腫瘤作用。

1.5.2細(xì)胞穿膜肽修飾的pH敏感性膠束

聚合物膠束作為靶向藥物遞送載體,因其在體內(nèi)穩(wěn)定性高、生物相容性好和載藥量大等優(yōu)點(diǎn),受到了廣泛關(guān)注[39]。Sethuraman等[40]研究發(fā)現(xiàn)聚合磺胺甲氧嘧啶[poly (methacryloylsulfadimethoxine),PSD],在pH 7.4時(shí)帶負(fù)電荷,而當(dāng)pH低于7.0時(shí)帶正電荷,因此,在正常生理?xiàng)l件下PSD能有效地屏蔽CPPs所帶的正電荷。Tat (YGRKKRRQRRR-NH2) 是經(jīng)典的細(xì)胞穿膜肽,具有極強(qiáng)的細(xì)胞穿透力且能直接作用于細(xì)胞核?；谝陨涎芯?/span>,Cheng等[41]利用pH敏感性的硬脂?；前芳籽踵奏?/span> (stearyl sulfadiazine,SA-SD)、細(xì)胞穿膜肽Tat和mPEG2000-DOPE修飾的聚乙二醇化磷脂,制備得到包載DOX的聚合物膠束。由于硬脂?；前芳籽踵奏ぞ哂?/span>pH敏感性,在pH 7.4條件下,帶負(fù)電荷的SA-SD通過(guò)靜電相互作用將Tat隱蔽在聚合物膠束內(nèi),使其穿膜活性受到抑制; 當(dāng)pH < 7.0時(shí),SA-SD所帶電荷由負(fù)轉(zhuǎn)為正,靜電相互作用被解除,使得Tat從膠束內(nèi)核解離,暴露于膠束表面,介導(dǎo)載藥膠束進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,從而選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞 (圖 1)。

這種pH敏感性聚合物膠束的最大優(yōu)點(diǎn)是,充分利用了載體材料的pH敏感特型與細(xì)胞穿膜肽的穿膜活性。特別是在正常生理?xiàng)l件下,CPPs被隱藏在聚合物膠束內(nèi)部,只有PEG鏈暴露在膠束表面,使得該藥物載體具有長(zhǎng)循環(huán)的特性。而當(dāng)其到達(dá)腫瘤部位后,在腫瘤酸性微環(huán)境的誘導(dǎo)下,聚合物膠束發(fā)生去屏蔽,使得CPPs的穿膜活性被激活,進(jìn)而將所載抗腫瘤藥物靶向遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。若能將特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體或配體與CPPs連接,進(jìn)一步制成具有主動(dòng)靶向功能的pH敏感性聚合物膠束,由于實(shí)體瘤的EPR效應(yīng),使得該pH敏感性聚合物膠束不僅能夠被動(dòng)靶向累積于腫瘤組織,而且能夠主動(dòng)靶向并介導(dǎo)抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,可能會(huì)大大降低系統(tǒng)性毒性。

西安瑞禧生物科技有限公司主要通過(guò)脂質(zhì)體和二親共聚物膠束偶連多種多肽類產(chǎn)品應(yīng)用于藥物傳遞系統(tǒng)，主要材料有DSPE-PEG-多肽，DPPE-PEG-多肽，DOPE-PEG-多肽，PLGA-PEG-多肽，PLA-PEG-多肽，PCL-PEG-多肽，DSPE-多肽 具體詳細(xì)產(chǎn)品如下：

1：細(xì)胞穿膜肽

細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs) 是一種由10～30個(gè)氨基酸殘基組成的陽(yáng)離子短肽。細(xì)胞穿膜肽能介導(dǎo)多種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞,如DNA、蛋白質(zhì)、抗體、顯像劑、納米粒和脂質(zhì)體等。將CPPs與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物 (如紫杉醇、喜樹(shù)堿和鬼臼毒素等) 共價(jià)連接后,能明顯提高這些藥物的抗腫瘤活性,同時(shí)也增強(qiáng)了這些藥物的水溶性、組織滲透力及在腫瘤組織中的分布。然而,由于細(xì)胞穿膜肽的選擇性較差、正電荷多而引起的體內(nèi)系統(tǒng)毒性、穩(wěn)定性差等問(wèn)題,使其在體內(nèi)的應(yīng)用受到了限制。因此,研究者想出了很多策略以提高細(xì)胞穿膜肽的腫瘤靶向性,如將腫瘤特異性靶向配體與細(xì)胞穿膜肽結(jié)合,或制成腫瘤靶向配體與細(xì)胞穿膜肽共修飾納米粒和脂質(zhì)體

CPPs 的分類以及統(tǒng)一的術(shù)語(yǔ)還沒(méi)有。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn), 得到不同的種類。最近有學(xué)者根據(jù)短肽的特點(diǎn)和來(lái)源將其分為3大類:蛋白衍生肽(protein derived CPPs), 如penetratin、TAT和pVEC等； 模型肽(model peptides) 如MAP和(Arg)7等；設(shè)計(jì)肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。從其兩親性性質(zhì)也可將其分為3類:兩親性CPPs (PaCPPs), 如MPG、 transportan、TP10、Pep-1;中等兩親性CPPs (SaCPPs),如penetratin, RL16；非兩親性 CPPs (NaCPPs),如 R9。

西安瑞禧生物可以提供對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品有：

DSPE-PEG-細(xì)胞穿膜肽CPPs

DPPE-PEG-細(xì)胞穿膜肽CPPs

DOPE-PEG-細(xì)胞穿膜肽CPPs

PLGA-PEG-細(xì)胞穿膜肽CPPs

PCL-PEG-細(xì)胞穿膜肽CPPs

PLA-PEG-細(xì)胞穿膜肽CPPS

DSPE-細(xì)胞穿膜肽CPPs

DOPE-細(xì)胞穿膜肽CPPs

部分細(xì)胞穿膜肽種類：

TAT (YGRKKRRQRRR-NH2) 是經(jīng)典的細(xì)胞穿膜肽,具有極強(qiáng)的細(xì)胞穿透力且能直接作用于細(xì)胞核.

MAP(KLALKLALKALKAALKLA) 是一種兩親性CPPs,能通過(guò)胞吞作用攜帶多種生物活性分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),但是作為藥物載體又缺乏特異性

具有pH選擇性且低毒性細(xì)胞穿膜肽TH[AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL-NH2]

pH響應(yīng)性細(xì)胞穿膜肽R6H4 (RRRRRR HHHH-NH2)

MPG (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cys)

MPGΔNLS (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cys)

Stearyl-R8 (st-RRRRRRRR-NH2)

EB1 (LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-amide)

Tat-DRBD (GRKKRRQRRRPQ-DRBD)

PF6 (St-AGYLLGK[kk2sa4qn4]INLKALAALAKKIL-NH2)

部分產(chǎn)品：

DSPE-PEG-TAT  

DPPE-PEG-TAT  

DOPE-PEG-TAT  

DSPE-TAT       

PLGA-PEG-TAT

PLA-PEG-TAT

PCL-PEG-TAT

DSPE-PEG-R8(RRRRRRRR-NH2)

PLGA-PEG-R8

PLA-PEG-R8

PCL-PEG-R8

2：主動(dòng)靶向多肽GE11 （腫瘤細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子肽）

多肽GE11是通過(guò)噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)獲得的小分子多肽，由11個(gè)氨基酸組成（YHWYGYTPQNVI），與大分子天然配體相比，多肽配體的優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)分子分子質(zhì)量小，免疫原性低；易擴(kuò)散及靶向性高，可以滿足靶向腫瘤的要求；對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。研究表明，GE11可以與EGFR特意性結(jié)合，并且GE11對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。研究結(jié)果表明GE11修飾的脂質(zhì)體對(duì)EGFR具有較高的靶向性。GE11修飾的膠束，以EGFR為靶點(diǎn)，結(jié)果表明制備的主動(dòng)靶向EGFR的膠束加速細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，EGFR在非小細(xì)胞肺癌表面過(guò)度表達(dá)。

EGFR的靶向多肽GE11，該多肽已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因和藥物的腫瘤靶向?qū)?。磷脂膠束具有較好的腫瘤組織穿透性，對(duì)其引入靶向性有可能獲得更好的腫瘤組織藥物聚集效果

多肽GE11 序列號(hào)：（YHWYGYTPQNVI）

西安瑞禧生物科技有限公司可以提供的產(chǎn)品有：

DSPE-PEG-GE11

DPPE-PEG-GE11

DMPE-PEG-GE11

DOPE-PEG-GE11

DSPE-GE11

PLGA-PEG-GE11

PCL-PEG-GE11

PLA-PEG-GE11

3：血管活性腸肽

血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是由14種28個(gè)氨基酸殘基組成的堿性多肽，屬于胰泌素/VIP 族的胃腸肽類激素。

4：YIGSR多肽修飾的脂質(zhì)體 

YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)(酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸)是來(lái)源于層粘連蛋白(laminin，LN)分子β1鏈的序列，能干擾腫瘤細(xì)胞膜黏附分子與基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，可有效抑制纖維肉瘤和黑素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。YIGSR肽具有抗腫瘤血管生成的作用，不但可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移灶，而且可以抑制腫瘤原發(fā)灶的生長(zhǎng)。將YIGSR肽連接到脂質(zhì)體表面，用脂質(zhì)體作為YIGSR肽的載體，在體內(nèi)可減少酶對(duì)YIGSR肽的破壞，增強(qiáng)抗轉(zhuǎn)移效果，有效地抑制實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移和自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移

多肽YIGSR  序列號(hào)：(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)(酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸)

西安瑞禧生物科技有限公司可以提供的產(chǎn)品有：

DSPE-PEG-YIGSR

DPPE-PEG-YIGSR

DMPE-PEG-YIGSR

DSPE-YIGSR

PLGA-PEG-YIGSR

PCL-PEG-YIGSR

PLA-PEG-YIGSR

5：NGR多肽修飾的脂質(zhì)體 （腫瘤新生血管靶向肽）

NGR多肽是一種能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD13受體結(jié)合的靶向肽。將NGR多肽與脂質(zhì)體相連接，得到NGR多肽修飾的脂質(zhì)體。通過(guò)靜脈注射該脂質(zhì)體，NGR多肽能與腫瘤新生血管上的CD13受體結(jié)合，將脂質(zhì)體定位于腫瘤組織，使得脂質(zhì)體中的藥物濃集于腫瘤部位，從而提高抗腫瘤效果。該文從NGR多肽入手，對(duì)NGR多肽的定義、NGR多肽修飾的脂質(zhì)體。

氨肽酶N是血管生成內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的一種蛋白酶，NGR序列片段可促進(jìn)肽與氨肽酶N的結(jié)合。Pastorino等[15]將NGR序列片段連接到包載DOX的SSL表面，首先